Питательные среды для культивирования бактерий

Для выделения чистых культур патогенных бактерий применяют оптимальные для их роста питательные среды с фиксированным рН. Большинство бактерий способно расти на различных питательных средах; исключение составляют хламидии и риккетсии, не растущие in vitro вне клеточных культур. Используемая среда должна содержать

Вещества, утилизируемые бактериями для различных биосинтетических процессов.

Универсальные источники азота и углерода -- бел- ковые гидролизаты (содержат полный набор аминокис- лот), пептиды и пептоны. Универсальные источники витаминов и микроэлементов -- экстракты белков жи- вотного или растительного происхождения и белковые гидролизаты.

рН среды. В некоторых случаях жизнедеятельность бактерий сопровождается сдвигом рН в кислую или щелочную сторону, что требует внесения в среды раз-- личных буферных систем (обычно применяют фосфат-- ный буфер). Сбалансированные среды отличают высо-- кая буферность и стабильный оптимум рН. Важно так- же создание оптимальной концентрации О 2 и СО 2 .

Посев и культивирование

При достаточном содержании патогенных бактерий в образце проводят посев на плотные пита-тельные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие среды обогащения. На практике выделение относительно неприхотливых бактерий обычно проводят на простых средах (например, на КА, агаре Плоскирева, тиогликолевом бульоне, агаре Сабуро и т.д.). Для выделения прихотливых видов в среды вносят питательные вещества (кровь, сыворотку, дрожжевой экстракт и др.), а такжепогло-тители токсических метаболитов, образующихся при росте бактерий (например, дре-весный уголь). Для посевов применяют микробиологические петли, реже иглы и шпатели.

Получение изолированных колоний

Для получения изолированных колоний на практике наиболее часто используют модифика-цию рассева по Дригальски. Для этого материал наносят на поверхность плотной питательной среды ближе к краю и делают «бляшку». Затем из неё материал распределяют по четырём квадратам, проводя петлёй штрихи, как показано на рис. 1-12, обжигая петлю после засева каждого квадрата. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их. Исключение составляет техника посева при бактериологическом исследовании мочи (техника штрихового засева показана на рис.1-13). Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.

Температура культивирования

Патогенные бактерии вариабельны в отношении температур, оптимальных для их роста, но большинство из них неплохо развивается при 35-37 °С. Исключение составляют некоторые атипичные микобактерии, возбудитель чумы, листерии и лептоспиры (температурный оптимум 20-30 °С), а также Campylobacter jejuni (температурный оптимум 42 °С).

Бактерии чётко разделяют по отношению к содержанию кислорода в атмосфере культиви-рования.

Аэробы. Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые факуль-тативно анаэробные виды также можно культивировать при атмосферном воздухе, но более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода. На практи-ке их чаще помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после её выгорания в атмо-сфере снижается содержание кислорода и повышается содержание СО 2 .

Анаэробы. Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах -- анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэ-робные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вейнберга.

Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэроб-ных бактерий, на другую -- анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислоро-да) -- рост анаэробов.

Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80 °С (для унич-тожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем про-водят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Вейнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пи-петкой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на её месте делают распил, колонию быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Методы культивирования

При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) инепрерывные (при проточном культивировании).

Стационарный способ -- наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций.

Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены систе-мами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, переме-шивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следователь-но, максимальному выходу биомассы.

Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно под-держивать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пре-бывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различ-ных БАВ (витамины, антибиотики и др.).

Первичная идентификация бактерий

В большинстве случаев изучение особенностей роста для первичной идентификации возбу-дителей проводят на колониях, выросших в течение 18-24 ч. Характер роста бактерий на раз-личных средах может дать много полезной информации. На практике используют сравнительно небольшой набор критериев. В жидких средах обычно учитывают характер поверхностного (образование плёнки) или придонного роста (вид осадка) и общее помутнение среды. На твёр-дых средах бактерии формируют колонии --изолированные структуры, образующиеся в результате роста и накопления бактерий. Колонии возникают как следствие роста и размноже-ния одной или нескольких клеток. Таким образом,пересев из колонии в дальнейшем даёт возможность оперировать с чистой культурой возбудителя. Рост бактерий на плотных сре-дах имеет больше характерных особенностей.

Размеры и форма колоний

Важные признаки колоний -- их размеры и форма. Колонии могут быть большими или мелкими. Величина колоний -- признак, позволяющий различать различные виды, роды и даже типы бактерий.

В большинстве случаев ко-лонии грамположительных бактерий мель-че колоний грамотрицательных бактерий. Колонии бактерий могут быть плоскими, приподнятыми, выпуклыми, иметь вдавлен-ный или приподнятый центр. Другой важный признак --форма краёв колоний. При изучении фор-мы колоний учитывают характер её поверх-ности: матовый, блестящий, гладкий или ше-роховатый. Края колоний могут быть ров-ными, волнистыми, дольчатыми (глубоко изрезанными), зубчатыми, эрозированными, бахромчатыми и т.д. Размеры и формы ко-лоний часто могут изменяться. Подобные изменения известны какдиссоциации. Наиболее часто обнаруживают S- и R-ducсоциации. S-колонии круглые, гладкие и выпуклые, с ровными краями и блестящей поверхностью. R-колонии -- неправильной формы, шероховатые, с зубчатыми краями.

Цвет колоний

При просмотре посевов также обращают внимание на цвет колоний. Чаще они бесцветные, белые, голубоватые, жёлтые или бежевые; реже -- красные, фиолетовые, зелёные или чёрные. Иногда колонии ирризируют, то есть переливаются всеми цветами радуги [от греч. iris, радуга]. Окрашивание возникает в результате способности бактерий к пигментообразованию. На специ-альных дифференцирующих средах, включающих специальные ингредиенты или красители, ко-лонии могут приобретать разнообразную окраску (чёрную, синюю и др.) за счёт включения красителей либо их восстановления из бесцветной формы. В данном случае их окраска не связана с образованием каких-либо пигментов.

Запах

Запах -- менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели, культуры листерий -- молочной сыворотки, протеев -- гнилостный запах, нокардий -- свежевскопанной земли.

Оглавление темы "Посев бактерий. Методы культивирования бактерий. Признаки колоний.":

При достаточном содержании патогенных бактерий в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие среды обогащения. На практике выделение относительно неприхотливых бактерий обычно проводят на простых средах (например, на КА, агаре Плоскирева, тиогликолевом бульоне, агаре Сабуро и т.д.).

Для выделения прихотливых видов бактерий в среды вносят питательные вещества (кровь, сыворотку, дрожжевой экстракт и др.), а также поглотители токсических метаболитов, образующихся при росте бактерий (например, древесный уголь). Для посевов применяют микробиологические петли, реже иглы и шпатели.

Получение изолированных колоний бактерий

Для получения изолированных колоний бактерий на практике наиболее часто используют модификацию рассева по Дригальски. Для этого материал наносят на поверхность плотной питательной среды ближе к краю и делают «бляшку». Затем из неё материал распределяют по четырём квадратам, проводя петлёй штрихи, как показано на рис. 11-12, обжигая петлю после засева каждого квадрата. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их.

Исключение составляет техника посева при бактериологическом исследовании мочи (техника штрихового засева показана на рис. 11-13). Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.

Температура культивирования бактерий

Патогенные бактерии вариабельны в отношении температур , оптимальных для их роста, но большинство из них неплохо развивается при 35-37 °С. Исключение составляют некоторые атипичные микобактерии, возбудитель чумы, листерии и лептоспиры (температурный оптимум 20-30 °С), а также Campylobacter jejuni (температурный оптимум 42 °С).

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР.

Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Под микробной колонией подразумевается потомство бактерий, возникающее в результате размножения одной микробной клетки.

Выделение чистой культуры микробов является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культур культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды. Очень широко применяются элективные питательные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воздействию определенных факторов внешней среды. Индивидуальная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых культур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры.

Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом.

Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при микроскопировании выявляются похожие клетки, в частности по размеру и окраске по Граму. Однако возможны исключения, например, колонии, вырастающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться кокковидные клетки, цисты и споры. Наконец, некоторые микроорганизмы проявляют грамвариабельность.

Посев штрихом. Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами (“штрихованные чашки”), но лишь некоторые из них почти всегда дают хорошо изолированные колонии даже при отсутствии навыков у экспериментатора. Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках.

При работе с анаэробами “штрихованные чашки” или чашки с внесенной в них жидкой культурой в атмосфере воздуха инкубируют затем в анаэростате. Для анаэробов необходимы свежеприготовленные среды, и посев штрихом следует проводить в течение первых 4 ч после их автоклавирования, чтобы избежать накопления растворенного кислорода.

1. Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора.

2. Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности агара в секторе 1. Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 с).

3. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 1 и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пламени и дают ей остыть.

4. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2 и затем наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3.

5. Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки для того чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала на поверхность агара. В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43-45°С. В пробирку вносят одну бактериальную петлю исследуемого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого прокаленной и остуженной петлей содержимое 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Расплавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливающегося роста. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового материала, шпатель переносят во вторую и третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал. Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чистой культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют параллельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 180°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся на петле, расходуется постепенно, и по линиям сетки, нанесенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Цель второго этапа бактериологического метода: получение чистой культуры микроорганизмов и ее накопление. Для этого проводят:

· Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

· Микроскопическое изучение изолированных колоний, а затем приготовление и просмотр мазков из этих колоний.

· Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

Культуральные признаки микробов определяются харак­тером роста их на питательных средах. Будучи постоянными, для каждого вида микроба, они являются важным диагно­стическим признаком.

Выделяя чистую культуру микроорганизма, следует обращать внима­ние на характер роста микроба, т.е. на культуральные особенности как на один из признаков, позволяющий идентифицировать род, вид микроорга­низма. При культивировании микроба на жидких средах, можно видеть рост бактерий в виде:

а) диффузного помутнения;

б) придонного и пристеночного роста в прозрачной среде;

в) поверхностной пленки;

г) «комочка ваты».

В полужидких средах можно наблюдать:

а) диффузный рост вокруг посева уколом (подвижные бактерии);

б) рост по ходу укола (неподвижные бактерии);

в) разрыв среды или образование пузырьков газа.

На плотных средах наблюдается:

а) рост отдельными колониями;

б) рост сплошным налетом.

Рост микробов на плотной питательной среде. Для изуче­ния свойств колоний микробы культивируют на плотных пи­тательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний.

По характеру колоний выделяют следующие типы:

· S-тип (от англ. smooth - гладкий) - колонии характеризуются круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией;

· R –тип (от англ. rough – шероховатый) колонии характеризуются шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S -форм в результате мутаций. Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссо­циации. Явление диссоциации у патогенных микробов на­блюдается под действием антибиотико - и химиотерапии, фак­торов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также факторов внешней среды.

· Помимо этих двух основных типов колоний существует слизистый М-тип (от лат. mucus - слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией. Образуется в процессе диссоциаций бактериальных культур.

Бактерии каждого вида формируют колонии с различными признаками. Их характер изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете, а также с помощью лупы или микроскопа с малым увеличением. В начале исследования чашку поворачивают дном к себе и рассматривают чашки в проходящем свете. При наличии разных колоний каждую из них нумеруют и описывают в отдельности. В протоколе отмечают следующие характеристики.

1. Величина колоний определяется ее диаметром (крупные – диаметром 4-6 мм и более, средние – 2-4мм, мелкие – 1-2мм и точечные – менее 1мм).

2. Форма колоний (правильная круглая, неправильная амебовидная, розеткообразная, ризоидная - корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев и т.п.).

3. Степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная).

4. Структуру колоний. По характеру структуры различают следующие виды ко­лоний:

· гиалиновые - бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

· зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелко - и грубозернистые;

· нитевидные или волокнистые, характеризующиеся на­личием длинных, густо переплетающихся нитей в толще ко­лонии. Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой.

5. Цвет колонии определяется пигментом, который проду­цирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды мик­робов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.

6. Характер поверхности (шероховатая, блестящая, матовая, сухая, влажная, гладкая, радиально или концентрически исчерченная).

7. Характер контура края. Различают ровные края в виде четко выраженной ли­нии и неровные. Последние делят на:

· фестончатый край, состоящий из крупных, слегка округ­лых или уплощенных зубцов правильной формы;

· волнистый край, который несколько отличается от фе­стончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко;

· эрозированный, или зазубренный, край, состоящий из острых зубцов различной величины и формы;

· бахромчатый край, имеющий нежные ворсинки. В некоторых случаях четко выраженная линия, отграни­чивающая колонию от поверхности среды, отсутствует. Такой край колонии называется расплывчатым.

8. Рельеф характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Различают рельеф выпуклый, вдавленный, плоский, конусообразный, куполообразный, плоский с конусовидным центром, с утолщенными валикообразными краями и т. п.

9. Консистенцию колонии , определяющую ее физиче­ское состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериологической петлей бактериальной петлей. По характеру консистенции колонии бывают:

· пастообразные, легко снимающиеся и размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;

· вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей

· волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соот­ветствующей величине и форме колонии;

· хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.

Колонии некоторых видов бактерий врастают в толщу питательной среды, что также определяют бактериологической петлей.

10. Запах - менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. Многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели, культуры листерий – молочной сыворотки, нокардий – свежевскопанной земли, протеев – гнилостный запах.

III. План практической работы

1. Изучить культуральные свойства колоний, выросших на МПА (просмотр посевов сделанных на предыдущем занятии)

2. Изолированную колонию (чистую культуру) отсеять (штрихами) на среду накопления (скошенный МПА)

3. Изучить и зарисовать характер роста различных бактерий на простых и сложных питательных средах

4. Заполнить таблицу « Классификация микроорганизмов по типам дыхания»

5. Решить ситуационные задачи

Исследование бактерий имеет большое практическое значение для человека. На сегодняшний день открыто большое количество прокариот, которые отличаются друг от друга по патогенности, области распространения, форме, размерам, количеству жгутиков и другим параметрам. Чтобы детально изучить данный штамм, применяется бактериологический метод исследования.

Какие существуют методы клеток?

Чтобы определить, являются ли бактерии патогенными, проводят исследование культуры различными способами. Среди них:

1. Бактериоскопический метод.

2. Бактериологический метод.

3. Биологический метод.

Бактериоскопический и бактериологический основаны непосредственно на работе с клетками прокариот, когда биологический анализ требуется для изучения влияния таких клеток на живой организм подопытных животных. По степени проявления тех или иных признаков заболевания ученый может сделать вывод о наличии или отсутствии патогенных бактерий в пробе, а также естественно их размножить в организме животного для получения их культуры и использования в других работах.

Бактериологический метод исследования отличается от бактериоскопического. В первом для анализа используется специально подготовленная культура живых прокариот, когда во втором проводится работа с мертвыми или живыми клетками на предметном стекле.

Этапы бактериологического метода исследования. Микробиология

Принцип изучения свойств бактериальной культуры может пригодиться как для ученых-микробиологов, которые поставили цель исследовать прокариотические клетки, так и для лаборантов, задача которых заключается в установлении патогенности или непатогенности бактерий, а затем диагноза пациента.

Методика изучения бактерий делится на три этапа:

1. Выделение бактерий из первоначальной пробы.

2. Высевание бактерий и выращивание изучение ее свойств.

Первый этап

Проба, или мазок, берется со свободной поверхности среды или у пациента. Таким образом мы получаем «коктейль» из множества видов бактерий, которые должны высеять на питательную среду. Иногда появляется возможность выделить сразу необходимые бактерии, зная их очаги распространения в организме.

Через двое-трое суток отбираются нужные колонии и высеваются на твердые среды чашек Петри с помочью стерильной петли. Во множестве лабораторий работают с пробирками, где может находиться твердая или жидкая питательная среда. Так и проводится бактериологический метод исследования в микробиологии.

Второй этап

После получения отдельных колоний бактерий проводится непосредственный макро- и микроанализ. Измеряются все параметры колоний, определяется цвет и форма каждой из них. Нередко проводится подсчет колоний на чашке Петри, а затем в исходном материале. Это имеет значение при анализе патогенных бактерий, от числа которых зависит степень заболевания.

Бактериологический метод исследования, 2 этап которого заключается в изучении отдельных колоний микроорганизмов, может быть сопряжен с биологическим способом анализа бактерий. Еще одна цель работы на этом этапе - увеличить количество исходного материала. Это можно сделать на питательной среде, а можно провести эксперимент в естественных условиях на живых подопытных организмах. Патогенные бактерии будут размножаться, и в результате кровь будет содержать миллионы клеток прокариот. Из взятой крови легко приготовить необходимый рабочий материал бактерий.

Третий этап

Самая важная часть исследования - это определение морфологических, биохимических, токсигенных и антигенных свойств культуры бактерий. Работа ведется с заранее «очищенными» культурами на питательной среде, а также с препаратами (зачастую окрашенными) под микроскопом.

Установить принадлежность патогенных или условно-патогенных бактерий к той или иной систематической группе, а также определить их устойчивость к лекарствам позволяет бактериологический метод исследования. 3 этап - антибиотики, т. е. анализ поведения клеток бактерий в условиях содержания лекарственных препаратов в окружающей среде.

Исследование устойчивости культуры к антибиотику имеет важное практическое значение, когда необходимо прописать для конкретного пациента необходимые, а главное, действенные препараты. Здесь и может помочь бактериологический метод исследования.

Что такое питательная среда?

Для развития и размножения бактерии должны находиться в заранее подготовленных питательных средах. По консистенции они могут быть жидкие или твердые, а по происхождению - растительные или животные.

Основные требования к питательным средам:

1. Стерильность.

2. Максимальная прозрачность.

3. Оптимальные показатели кислотности, активности воды и других биологических величин.

Получение изолированных колоний

1. Метод Дригальского. Он заключается в том, что на бактериальную петлю наносится мазок с различными видами микроорганизмов. Этой петлей проводят по первой чашке Петри с питательной средой. Далее, не меняя петлю, методом остаточного материала проводят по второй и третьей чашкам Петри. Так, на последних образцах колонии бактерии будут засеваться не слишком плотно, тем самым упрощается возможность найти необходимые для работы бактерии.

2. Метод Коха. В нем используются пробирки с расплавленной питательной средой. Туда помещается петля или пипетка с мазком бактерий, после чего содержимое пробирки выливается на специальную пластинку. Агар (или желатин) застывает через какое-то время, а в его толще легко обнаружить нужные колонии клеток. Важно перед началом работы развести смесь бактерий в пробирках, чтобы концентрация микроорганизмов не была очень большой.

Этапы которого основаны на выделении нужной культуры бактерий, не обходится без этих двух способов нахождения изолированных колоний.

Антибиотикограмма

Визуально реакцию бактерий на препараты можно заметить двумя практическими способами:

1. Метод бумажных дисков.

2. Разведение бактерий и антибиотика в жидкостной среде.

Метод бумажных дисков требует наличия культуры микроорганизмов, которые были выращены на твердой питательной среде. На такую среду кладут несколько бумажек округлой формы, пропитанных антибиотиками. Если препарат успешно справляется с нейтрализацией бактериальных клеток, после такой обработки останется участок, лишенный колоний. Если же реакция на антибиотик отрицательная, бактерии выживут.

В случае использования жидкой питательной среды сперва готовят несколько пробирок с культурой бактерий разных степеней разведения. В эти пробирки добавляют антибиотики, и в течение суток наблюдают за процессом взаимодействия вещества и микроорганизмов. В конечном итоге получается качественная антибиотикограмма, по которой можно судить об эффективности препарата для данной культуры.

Основные задачи анализа

Здесь перечислены по пунктам цели и этапы бактериологического метода исследования.

1. Получить исходный материал, который будет использоваться для выделения колоний бактерий. Это может быть мазок с поверхности любого предмета, слизистой оболочки или полости органа человека, анализ крови.

2. на твердой питательной среде. Через 24-48 часов на чашке Петри можно обнаружить колонии бактерий разных видов. Отбираем по морфологическим и/или биохимическим критериям нужную и проводим уже с ней дальнейшую работу.

3. Размножение полученной культуры. Бактериологический метод исследования может опираться на механический или биологический способ увеличения численности культуры бактерии. В первом случае ведется работа с твердыми или жидкими питательными средами, на которых в термостате размножаются бактерии и образуют новые колонии. Биологический способ требует естественных условий увеличения численности бактерий, поэтому здесь микроорганизмами заражается подопытное животное. Через несколько суток в пробе крови или мазке можно обнаружить множество прокариот.

4. Работа с очищенной культурой. Чтобы определить систематическое положение бактерий, а также их принадлежность к возбудителям заболеваний, необходимо провести тщательный анализ клеток по морфологическим и биохимическим признакам. При исследовании патогенных групп микроорганизмов важно знать, насколько эффективно действие антибиотиков.

Это была общая характеристика бактериологического метода исследования.

Особенности проведения анализа

Главное правило проведения бактериологического исследования - это максимальная стерильность. Если идет работа с пробирками, посевы и пересевы бактерий должны проводиться только над нагретой спиртовкой.

Все этапы бактериологического метода исследования требуют использования специальной петли или пастеровской пипетки. Оба инструмента должны быть предварительно обработаны в пламени спиртовки. Что касается пастеровской пипетки, то тут перед термической стерилизацией необходимо отломать кончик пипетки пинцетом.

Техника посева бактерий тоже имеет свои особенности. Во-первых, при посеве на твердые среды проводят бактериальной петлей по поверхности агара. Петля, конечно же, уже должна иметь на поверхности образец микроорганизмов. Также практикуется посев внутрь и в этом случае петля или пипетка должны достичь дна чашки Петри.

При работе с жидкими средами используются пробирки. Здесь важно следить, чтобы жидкости не касались краев лабораторной посуды или пробки, а используемые инструменты (пипетка, петля) не дотрагивались до посторонних предметов и поверхностей.

Значение биологического метода исследования

Анализ пробы бактерий имеет свое практическое применение. Прежде всего бактериологический метод исследования может использоваться в медицине. К примеру, необходимо изучить микрофлору больного, чтобы установить правильный диагноз, а также выработать правильный ход лечения. Здесь помогает антибиотикограмма, которая покажет активность лекарственных препаратов против возбудителя заболеваний.

Анализ бактерий используется в лаборатории для определения таких опасных заболеваний, как туберкулез, возвратный тиф или гонорея. Также он применяется для изучения бактериального состава миндалин, полостей органов.

Бактериологический метод исследования можно использовать для определения загрязненности среды. По данным о количественном и качественном составе мазка с поверхности какого-либо предмета определяется степень заселенности данной среды микроорганизмами.